“敲除的基因组DNA大概是几千个碱基 ， 虽然敲除几个碱基也可能使得YAP因子失去功能 ， 但是很可能导致新的异常蛋白的产生 ， 从而引入无法排除的因素 。 ”付丽娜说 。 团队必须确保YAP基因的完全沉默 。 为此 ， 他们对CRISPR/Cas9基因编辑技术进行了改良 ， 使其能够对巨大的YAP基因位点进行较大片段的删除 。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术 ， 团队获得了YAP特异性敲除的人胚胎干细胞 ， 通过定向分化技术 ， 将人胚胎干细胞定向诱导分化为间充质干细胞 。 “YAP缺失的人间充质干细胞表现出严重的加速衰老表型 。 ”刘光慧说 ， YAP在维持人成体干细胞年轻态中发挥着关键作用 ， 虽然YAP在某些肿瘤细胞中被证明具有“癌基因”的功能 ， 但在人间充质细胞中却扮演着“年轻因子”的角色 。
全新的“两点一线” 找到YAP蛋白“铁杆伙伴”和“接令员”
YAP通过与转录因子TEAD的相互作用来启动下游基因的转录 ， 也就是说TEAD和YAP是“铁杆伙伴” 。 此前研究发现 ， YAP和TEAD通过YAP的N末端和TEAD的C末端间相互作用形成蛋白复合物 ， 该蛋白复合物在YAP介导的细胞增殖中发挥着关键性的作用 。
团队的第二个任务是寻找YAP的“接令员” 。 “我们假设YAP的某个或某些靶基因介导了人间充质干细胞年轻态的调节 。 ”刘光慧说 ， “通过系列实验 ， 我们发现YAP可以转录激活FOXD1 ， 这是一个新型的YAP靶基因 ， 之前从未被报道过 。 ”
叉头框（FOX）蛋白家族包含50多个转录因子 ， 在胚胎发育、细胞周期调控、糖类和脂类代谢、衰老调节等多种生物学过程中发挥作用 。 FOXD1是其中一个转录因子 。 付丽娜解释 ， 之前有报道指出FOXD1能调节器官发育 ， 并具有促进细胞增殖和细胞重编程的活性 。
“我们首先对YAP敲除的人间充质干细胞进行了RNA测序 ， 进一步结合转录因子结合元件的预测 ， 我们推断FOXD1可能是YAP的一个新型靶基因 。 ”付丽娜说 ， 随后 ， 为了验证推断 ， 团队利用染色质免疫沉淀（ChIP）方法“钓”出能够特异性地结合FOXD1启动子DNA的蛋白（即YAP） ， 最终证明是FOXD1从YAP处接过“命令” ， 开启调节细胞“年轻化”的分子程序 。
【两点一线 探寻细胞生命的“年轻因子”】“YAP是上游 ， FOXD1是下游 。 它们是一对命运共同体 。 ”刘光慧解释 ， 随着细胞衰老 ， YAP和FOXD1的表达都发生了一致性下调 。
或助力基因治疗 未来可有效干预衰老相关疾病
从干细胞出发 ， 发现机制机理 ， 再回到细胞、生命体验证 ， “青春之河”的发现必须在生物体中证明自己的“魔力” 。
“我们在三种细胞衰老模型中证明了YAP-FOXD1通路的去衰老作用 ， YAP或FOXD1的过表达能使衰老的人间充质干细胞重新获得增殖能力 。 ”付丽娜说 。 另一方面 ， 细胞实验的结果提示了过表达YAP或FOXD1可能使衰老的动物间充质组织（如关节）变得更加年轻 。
团队接下来在动物身上实施了基因治疗 。 “我们在小鼠体内证明了YAP或FOXD1蛋白的过表达作为骨关节炎基因治疗方案的可行性和有效性 。 ”刘光慧说 ， 团队以慢病毒载体为基因导入媒介 ， 将编码YAP或FOXD1蛋白的慢病毒注射到患有骨关节炎的小鼠的关节腔内 。 数周的YAP或FOXD1基因治疗均可显著降低关节软骨中衰老细胞的比例 ， 有效抑制关节软骨退化及关节腔炎症 ， 从多个方面改善骨关节炎的病理表型 。
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