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光学显微镜和电子显微镜的区别 光学显微镜和电子显微镜的区别( 四 )

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共聚焦激光扫描显微镜现已成为使用广泛的高分辨率三维光学成像工具，通过移动透镜系统对半透明物体进行三维扫描，在计算机系统的辅助下，对样品从外观到内在、从静态到动态、从形态到功能进行全方位的观察 。
05 真正突破
对“阿贝极限”的真正挑战要从20世纪90年代说起 。
1994年，德国的斯蒂芬·黑尔 (Stefan Hell) 提出了受激发射损耗 (STimulated Emission Depletion，简称STED) 技术，用以突破“阿贝极限”实现超高分辨率成像 。所谓“阿贝极限”，是光学元件的衍射效应造成的 。
光学显微镜的照明光经光学系统聚焦后在样品上形成的光斑实际上是个光的衍射斑，在此斑范围内的样品会发出照明光引发的荧光，使这部分样品的细节信息无法被分辨 。要实现超越“阿贝极限”，关键是设法减少单个扫描点处的有效荧光发光面积 。
黑尔提出的方法十分巧妙，他设想同时使用两束激光来照射样品，一束为激发光，另外一束为空心形的受激发射损耗光，样品上发生受激发射损耗效应的部分不能发出荧光，仅样品的中心区域可发出辐射荧光，这样就可达到大大降低荧光激发半径的目的 。
可以想象，实现这项技术的难度相当大，黑尔于2000年终于用两台钛宝石飞秒脉冲激光器实现了超高分辨率受激发射损耗显微成像 。
斯蒂芬·黑尔(Stefan Hell)
除了受激发射损耗显微技术，还有几项重要的技术获得了突破 。
美国的埃里克·白兹格 (Eric Betzig) 与威廉·莫尔纳 (William Moerner) 分别独立发现了单分子开关的方法，利用图像多次叠加的技术得到单分子的精确定位，再将这些分子的荧光图像合成，可获得比传统光学显微镜至少高10倍以上的分辨率 。
白兹格将该项技术称为光激活定位显微术 (Photo Activated Localization Microscopy，简称PALM) 。
埃里克·白兹格(Eric Betzig)
威廉·莫尔纳(William Moerner)
美国哈佛大学的华裔女科学家庄小威 (Xiaowei Zhuang) 等人发明了利用有机染料 (不用荧光蛋白) 对荧光分子的可调控性对单分子进行精确定位，再用图片重组方式获得超高分辨率显微镜图像的技术——随机光学重建显微术 (STochastic Optical Reconstruction Microscopy，简称STORM)。
庄小威积极推动了这项技术的发展，既实现了三维同时超分辨率显现，又进一步提高了该技术的成像速率 (庄小威的成果与埃里克·白兹格的成果在2006年同时发表，只是庄小威投稿的日期晚了4个月) 。
庄小威(Xiaowei Zhuang)
正是由于上述多项技术的创新，光学显微镜最终实现了“阿贝极限”的真正突破 (分辨率达20纳米)，使能进行活体物质观察的光学显微镜又重新焕发出青春，这对多个前沿研究领域产生了重大影响，尤其是为常温下活体生物学研究带来了重大机遇 。
生物学家能够实时观察到生物分子如何在大脑神经细胞之间生成神经突触，看到病毒颗粒侵入细胞的全过程，甚至还可追踪帕金森、阿尔兹海默症、亨廷顿症患者体内相关蛋白的累积过程 (莫尔纳、黑尔、白兹格三人被授予2014年诺贝尔化学奖(很遗憾庄小威未能获奖)) 。
突破“阿贝极限”的光学显微镜
受激发射损耗显微镜(STED)(左)与一般光学显微镜图像(右)的对比
共聚焦显微镜(CLSM)(左)与受激发射损耗显微镜(STED)图像(右)的对比
难能可贵的是，黑尔在获诺贝尔奖之后给自己制定了进一步提高分辨率的奋斗目标——被他称为“后诺奖超分辨率” 。
2017年初，他的团队在Science发表了题为“Science-2017-Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”的论文，介绍了结合了STED、PLAM和STORM技术优势的MINFLUX超分辨率荧光显微镜 (也称为纳米显微镜)。研究团队的实验实现了6纳米的分辨率，他们的目标是实现1纳米的分辨率，使生物学家不仅可看清病毒的结构，还可清晰地观察病毒感染细胞的整个过程，最终找到灭杀病毒的有效方法 。

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