4 。蛋白质粗品的获取
选择合适的方法将所需的蛋白质与其他外源蛋白质分离 。更方便有效的方法是基于蛋白质溶解度的差异进行分离 。以下是常用的方法:
(1)不同的等电点沉淀法蛋白质中的等电点不同，可以用等电点沉淀法相互分离 。
⑵不同的盐析方法需要不同的盐饱和度，因此可以通过调节盐浓度来沉淀目的蛋白 。通过盐析沉淀的蛋白质仍然保持其天然性质，并且可以在不变性的情况下再次溶解 。
(3)有机溶剂沉淀乙醇、丙酮等中性有机溶剂的介电常数比水低 。它可以降低大部分球状蛋白在水溶液中的溶解度，然后从溶液中沉淀出来，所以可以用来沉淀蛋白质 。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水合层，促使蛋白质分子变得不稳定并沉淀 。由于有机溶剂能使蛋白质变性，使用该方法时，应注意低温操作，选择合适的有机溶剂浓度 。
5 。蛋白质的纯化
等电点沉淀和盐析法得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，需要进一步分离纯化才能得到一定纯度的样品 。有时有必要结合这些方法来获得高纯度的蛋白质样品 。常用的净化方法有:
(1)凝胶过滤法
也叫分子筛分离法 。它主要是利用具有多孔网络结构的凝胶分子筛，根据被分离物质分子大小的不同进行分离 。它允许大颗粒通过，同时保留小颗粒，从而使大小不同的蛋白质分子通过凝胶相互分离 。该方法适用于分离和纯化水溶性聚合物，如蛋白质、酶、核酸和激素 。
这种方法有以下优点:
①分离条件温和，因此不稳定分子也可以用这种方法分离 。
②样品回收率高，几乎达到100% 。
③实验重复性高 。
④完成手术的时间相对较短，所需设备简单经济 。
(2)离子交换色谱法
是一种常用的分离纯化方法 。最常用的是使用各种离子交换剂的柱色谱法 。如果带电基团带负电，可以结合阳离子，称为阳离子交换剂；如果带电基团带正电，可以结合阴离子，称为阴离子交换剂 。通常使用各种改进的纤维离子交换器 。这种纤维经过各种离子化基团的化学处理，如阴离子交换剂DEAE-纤维素(即二乙氨基乙基纤维素)和阳离子交换剂CM-纤维素(羧甲基纤维素) 。
蛋白质分子既带正电，也带负电 。如果pH值增加，这些分子带负电；如果pH值降低，就会带正电；在等电点，分子包含等量的正负电荷 。这一特性对蛋白质的纯化大有裨益 。例如，可以将蛋白质混合物的pH值调节到某一点，在该点，溶液中所需的蛋白质带正电 。此时，如果混合物在阳离子交换剂上进行色谱分离，可以除去许多阳离子蛋白 。之后，增加pH以将所需的蛋白质溶液变成负电荷，然后在阴离子交换剂上进行层析，从而可以除去许多阴离子成分 。
(3)电泳
电泳是鉴定生物大分子和分析其纯度的基本工具 。这种方法是基于蛋白质分子具有可电离的基团，在溶液中可以形成带电离子，因此在电场的作用下会发生运动 。由于各种蛋白质分子的静电荷不同，蛋白质被纯化 。
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