图15. 不同浓度甲醇处理，对GM-CSF体外激活不同时长的外周血单个核细胞上磷酸化分子检测的影响 。正常供体的全血在37°C下用GM-CSF在体外处理20min 。一部分固定和通透样品在4°C下用50%甲醇处理（A），另一部分用80%甲醇处理（B） 。洗涤后，所有样品用(_?_)P-STAT5、(_□_)P-ERK和(_Δ_)P-S6染色 。
虽然甲醇进一步处理对某些磷酸化表位的评估很重要，但它也具有降低（或消除）用于检测特定细胞群的其他重要表位的信号 。根据作者经验，对人血液或骨髓中的某些髓系-单核细胞标记物（CD14、CD33、CD64）影响较大，而对干细胞或祖细胞标记物（CD34、CD117）影响较小 。
图16. 甲醇处理对人外周血单核细胞CD14染色的影响 。在固定和渗透之前（左）或之后（右）染色CD14 PE-Cy7 。样品用50%（上）或80%（下）甲醇处理 。左上-左下比较显示了不同浓度甲醇处理对染料的影响，左右比较显示了甲醇处理对抗原表位的影响 。
非贴壁组织培养细胞的固定和通透
组织培养细胞（锚定非依赖性细胞系）的常规固定和通透是通过甲醛固定，无水甲醇对细胞质和核膜进行通透 。通常需同时对细胞表面和细胞质或核内表位进行染色，一般会先染表面再固定通透染胞内，尤其是单独使用酒精固定处理而改变（如CD19）或破坏（如CD14、CD15、CD64）的细胞表面标记 。
甲醛固定剂最佳浓度的测定
磷酸化表位的最佳检测似乎受到用于固定不同类型细胞的甲醛浓度的影响 。如图17所示，在用0.05到0.4%的甲醛（37°C，10min）处理后，K562细胞中的P-STAT5最佳检测 。由于潜在表位交联/固定的程度与甲醛浓度、孵育时间和温度成正比，所有这三个变量每次都应进行相同的控制和执行 。如图17所示，在较高的最终甲醛浓度下，P‐STAT5信号降低，可能是由于过度固定和抗体结合物限制了磷酸表位的可及性 。如图17所示，单独用无水甲醇处理（无甲醛：第一数据点）产生背景水平的信号 。
图17. 甲醛浓度对K562细胞中P-STAT5染色结果的影响 。不同浓度甲醛固定细胞，37°C，10min，渗透并用抗P-STAT5PE染色 。
非贴壁培养细胞的常规固定、通透和抗体染色
对于非贴壁组织培养细胞的固定和通透，我们在组织培养基（通常含有15-20%的FBS）中直接向亚融合细胞（理想情况下在收获前12-24小时重新喂食）中添加最佳浓度的甲醛，将细胞放回37°C的组织培养箱中培养10分钟，然后离心（400×g，10分钟），并使用涡流混合器进行再悬浮（注：此时细胞聚集，需要用涡流进行剧烈处理，以实现所有细胞的再悬浮） 。涡流时，添加无水甲醇（储存在-20°C下），添加～1 mL无水甲醇每107个细胞 。在这一点上，细胞可以在-20°C的密封容器中储存数周，而磷酸化表位（目前测试的表位）的检测没有明显减少 。
对于细胞内表位的染色，将3–5×106个细胞放入每根试管（我们常规在1.2 mL微管中对组织培养细胞进行染色） 。离心管（对于冷冻微量离心机，使用10 000rpm持续12 s），小心地吸取上清液，并将细胞团重新悬浮在1mL冷（4°C）洗涤液（Dulbecco的PBS/5%FCS或Dulbecco的PBS/5%无蛋白酶BSA）中，同时涡旋 。将试管放在冰上5分钟，以使缓冲液平衡并除去残余酒精 。如上所述离心 。重复上述步骤，用冷洗涤液清洗两次 。
在最后一个离心步骤后小心地去除上清液，并将细胞重悬在100μL抗体预混物中 。重要的是，每种抗体都要滴定，以确保最佳的信噪比 。冰（4°C）上避光孵育30分钟 。
将细胞重新悬浮在0.5 mL冷洗涤液中进行流式细胞术分析（如果细胞要在1-2hr内进行分析） 。更长时间后再进行分析，则将洗涤后的细胞离心，并将细胞团重悬在冷PBS/0.1%多聚甲醛中 。在0.1%多聚甲醛中固定并在4°C避光下储存的细胞至少稳定24hr（光散射和磷酸表位检测） 。应注意的是，一些磷酸表位的信号强度在冷洗涤液（如P-S6）中最终再悬浮的几分钟内开始显著降低 。对于这些表位，强烈建议立即将细胞置于PBS/0.1%甲醛中，这可显著降低信号丢失率 。
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