概要
利用流式细胞术（intracellular cytometry）对细胞内靶点进行分析提出了许多技术挑战，这些挑战在测量细胞表面表位或测量活细胞中染料摄取/处理（例如钙黄绿素AM）时通常不会遇到 。一般来说，细胞（悬浮液）必须首先“固定”以保存和维持目标表位的结构和位置，然后“通透”以允许探针（例如抗体）理想地进入所有细胞室（细胞质、线粒体、核糖体、细胞核等） 。
一般来说，细胞固定是通过使用交联固定剂（如甲醛、戊二醛）或低分子量醇（甲醇、乙醇）来完成的，它们通常起到“凝固”蛋白质的作用 。甲醛的优点是一般保持天然蛋白质的整体构象 。然而，由于甲醛在肽、多糖和脂类上产生多个反应位点，因此交联可以隐藏或隔离表位，使得它们在固定后不能自由地被抗体探针获得 。在翻译后蛋白质修饰（如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等）的研究中，甲醛固定的另一个好处是，甲醛似乎既能“固定”目标氨基酸（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）的修饰，并且还抑制活细胞中这些靶点的降解（例如，磷酸化的磷酸酶去除，甲基化的去甲基化酶去除，等等） 。相比之下，酒精固定通常会导致一些（磷酸化和潜在的其他蛋白质）修饰的检测较差 。
全血样本的固定
免疫学领域的研究经常利用外周血、淋巴结或骨髓细胞，通常通过初步纯化步骤（Ficoll–Hypaque、低渗溶解、氯化铵）去除红细胞 。此外，初步纯化技术可以去除潜在的靶细胞群（例如，使用Ficoll–Hypaque的细胞损失） 。本节首先介绍含红细胞样本的固定和渗透技术，然后介绍分离细胞群（组织培养细胞、分离淋巴细胞、单核细胞等）的固定和渗透技术 。
固定后，进行细胞通透，以获得进入细胞内部 。渗透用试剂包括有洗涤剂（例如Triton X-100，NP-40）或皂化剂（例如皂甙）或低分子量醇（甲醇或乙醇） 。本文介绍一种用于临床样本（全血、骨髓）的固定和渗透技术 。将固定剂甲醛直接添加到临床样本中（立即“固定”磷酸化表位，并防止信号抑制剂从细胞中分离出来，从而导致其抑制作用的快速逆转） 。再以适当的浓度和时间将Triton X-100直接添加到样品（仍含有甲醛）中，可实现红细胞溶解和白细胞固定，而不会造成白细胞数量的显著损失 。注，严格遵守孵育时间是很重要的 。
如图14所示，使用甲醛/Triton X-100技术固定渗透的健康人全血各群分布 。单核细胞群（蓝色）的位置是用CD14确定的 。然而，单用散射光信号从细胞碎片中分离淋巴细胞是有问题的，红细胞裂解产生大量碎片与淋巴细胞重叠 。结合CD45/CD14可将淋巴、单核、粒细胞清晰区分 。显示的数据是在红细胞裂解步骤后的一次洗涤结果，增加额外的洗涤步骤可显著减少碎片数量 。
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图14. 甲醛固定人全血，TX-100通透 。用CD14-PE-Cy7和CD45-KromeOrange鉴定白细胞群 。碎片（红色）通过CD45与SS（上图C）进行识别 。使用CD14 PE-Cy7（未显示）完成外周血单核细胞的鉴定（图中蓝色） 。
全血染色材料
全血固定通透过程
甲醇对表位染色的影响
一些细胞内或核内的表位在使用上述甲醛-Triton固定、通透后仍然很难被抗体探针获得 。这可能是所有类似的醛-洗涤剂（仅）固定和渗透技术的局限性，如磷酸化STAT蛋白就不能被检测到 。用冷（4°C）甲醇处理固定和渗透细胞5-10min后即可检测到这些表位，但须小心验证甲醇处理的效果，特别是荧光抗体染色后处理和使用下文所述的串联染料时 。如图15所示，用高达50%的冷甲醇处理固定和渗透的全血（使用GM-CSF激活）后，P-STAT5染色结果和未处理样品信号强度相似 。而，用80%冷甲醇处理会产生明显更强的P-STAT5信号 。图15还显示了50%（上）和80%（下）浓度的甲醇处理对P-ERK和P-S6染色（核糖体S6蛋白）的影响：P-ERK信号强度的变化最小，P-S6信号降低约20% 。因此，需测试确定不同浓度甲醇处理对不同靶表位的影响 。
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